O que significa um teste negativo para COVID19?

Cenário 1: Uma pessoa faz uma viagem internacional de 4 dias de duração com uma comitiva próxima de assessores, e no retorno 23 deles testam positivo para COVID19 pelo teste de RT-PCR. Essa pessoa faz 2 testes que trazem resultado negativo.

Cenário 2: Homem de 50 anos sem problemas de saúde é hospitalizado por falta de ar que iniciou uma semana após quadro gripal. Exames de imagens mostram lesões pulmonares bilaterais. Quadro evolui rapidamente para insuficiência respiratória aguda, e apesar dos melhores cuidados intensivos o paciente morre após 10 dias em ventilação mecânica. Dois testes de RT-PCR são realizados durante o internamento e ambos têm resultado negativo.

Testes de RT-PCR

RT-PCR significa reação em cadeia da polimerase – transcriptase reversa. De forma muito simplificada, esse teste usa pequenas “sondas” (primers) que se ligam a regiões conhecidas do RNA viral, que é então amplificado em 40 ciclos sucessivos de mudança de temperatura, dobrando o número de cópias do vírus existentes a cada ciclo (“reação em cadeia”). O equipamento consegue detectar quando um certo limiar de material genético é ultrapassado. Como o número final de cópias é proporcional ao número inicial, podemos entender que quanto menos ciclos forem necessários para que esse limiar seja ultrapassado, mais material genético viral estava presente na amostra testada.

Existem múltiplos tipos de RT-PCR para COVID19

O desenvolvimento de um novo teste de RT-PCR começa o conhecimento do código genético do vírus. Por isso foi tão importante quando, em 11 de Janeiro, meros 2 dias após a OMS ter anunciado a descoberta de um novo coronavírus patogênico a humanos, a China rapidamente sequenciou e divulgou o genoma completo do vírus (naquela época chamado de 2019-nCoV). Com essa sequência em mãos, pesquisadores rapidamente desenvolveram as sondas (primers) usadas nos testes de RT-PCR para a presença do SARS-CoV-2 (nome atual do vírus) em amostras de pacientes. Isoladamente, vários laboratórios anunciaram seus testes, mas cada um deles amplificava regiões diferentes do vírus.

Protocolos originais de RT-PCR para SARS-CoV-2 divulgados pela OMS. Disponível em https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/whoinhouseassays.pdf?sfvrsn=de3a76aa_2

Testes que amplificam regiões diferentes, com reagentes diferentes, terão resultados ligeiramente diferentes. Isso ficou muito claro com a confusão que ocorreu nos Estados Unidos quando o teste “perfeito” que o CDC criou apresentou falhas graves em uma das reações, atrasando a contenção da epidemia e possivelmente contribuindo em milhares de mortes. Atualmente já existem centenas de empresas divulgando seus testes diagnósticos para COVID, e a performance de cada um desses testes é diferente. No Brasil, diferentes laboratórios usam diferentes protocolos — encontrei notícias para o protocolo alemão, mas também para o protocolo do CDC americano. De fato, o protocolo alemão original é tido como referência pelo Ministério da Saúde. Há poucos estudos reportados que compararam dois protocolos diferentes em amostras de pacientes sabidamente COVID19. Um deles, publicado em 30 de março, mostrou que uma modificação no protocolo alemão aumentaria em 40% o número de resultados positivos em amostras respiratórias. Não há notícias, no entanto, de que essa modificação esteja sendo utilizada nos laboratórios brasileiros.

Validação dos testes

Nas primeiras semanas da epidemia, era requisito do Ministério de Saúde que todo laboratório que confirmasse seu primeiro caso de COVID19 por RT-PCR precisaria passar por uma contra-prova em laboratório de referência para validação do método utilizado. Com a rápida ascensão no número de casos confirmados, esse requerimento caiu e agora muitos mais laboratórios estão ofertando esses testes. Nunca houve qualquer tipo de validação de resultados inicialmente negativos: esses nunca foram questionados pelo Ministério da Saúde, embora a falha em se diagnosticar casos verdadeiramente COVID19+ seja muito mais deletéria do ponto de saúde pública do que o falso diagnóstico de COVID19 em um paciente com outra enfermidade.

Qual é a sensibilidade dos testes de RT-PCR no diagnóstico de COVID19?

Essa é uma questão complicada de ser respondida, já que para calcularmos a sensibilidade de um teste diagnóstico precisamos compará-lo com o método diagnóstico “padrão ouro” (gold standard). Acontece que a COVID19 é uma doença recém descoberta, e ainda não temos muitos reagentes e anticorpos descritos para diagnóstico preciso. Infelizmente, nem em autópsias conseguimos provar com exatidão que a causa mortis foi COVID19, já que o único teste validado clinicamente até o momento é justamente a RT-PCR. Ou seja, no momento o padrão ouro é a RT-PCR. E como podemos ver na figura abaixo, os primeiros testes de RT-PCR foram desenvolvidos baseados no código genético do vírus baixado da internet e validados em amostras de SARS e outros vírus respiratórios, e não diretamente em amostras de pacientes COVID19 (que não estavam disponíveis aos pesquisadores no início da pandemia).

Curiosamente, o primeiro teste RT-PCR publicado para COVID19 (protocolo alemão) foi desenvolvido antes mesmo que os pesquisadores tivessem acesso a amostras do SARS-CoV-2, amplificando somente regiões homólogas ao vírus da SARS (SARS-CoV) em amostras antigas de cultura celular.

Então como outros países fazem diagnóstico de COVID19 em pacientes hospitalizados?

Basicamente, testando à exaustão. Se a equipe médica considera que o quadro do paciente é compatível com COVID19, repetem o mesmo teste em diferentes amostras, coletadas de forma seriada, até que qualquer uma delas dê resultado positivo. Obviamente essa estratégia requer laboratórios capazes de rodar muitos testes e retornar o resultado rapidamente à equipe solicitante. Vejamos alguns exemplos.

Time Course of Symptoms, Supplemental Oxygen Requirements, Hospital Admission, and Discharge of Patients Infected With SARS-CoV-2
Young BE, Ong SWX, Kalimuddin S, et al. Epidemiologic Features and Clinical Course of Patients Infected With SARS-CoV-2 in Singapore. JAMA. Published online March 03, 2020. doi:10.1001/jama.2020.3204 [https://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2762688]

Nessa imagem, cada linha é um paciente diferente hospitalizado por COVID19 em Cingapura. As “casas” são os dias, as cores refletem sintomas e gravidade a cada dia. Cada bolinha indica o resultado do teste de RT-PCR (protocolo alemão modificado) coletado por swab de nasofaringe naquele dia: verde = negativo, vermelho = positivo, branco = não realizado. Esse estudo tem um viés importante, já que só pacientes confirmados por RT-PCR foram descritos. Logo não sabemos quantos outros casos tiveram resultados negativos repetidos no início do quadro e que potencialmente estavam infectados mas foram incorretamente dispensados. Tendo isso em mente, notem a alternância entre resultados positivos e negativos, principalmente a partir da segunda semana após o início dos sintomas. Na próxima figura podemos analisar a “carga viral” (termo controverso nesse contexto) presente em cada amostra analisada de cada paciente.

Young BE, Ong SWX, Kalimuddin S, et al. Epidemiologic Features and Clinical Course of Patients Infected With SARS-CoV-2 in Singapore. JAMA. Published online March 03, 2020. doi:10.1001/jama.2020.3204 [https://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2762688]

Como disse no começo desse texto, o teste de RT-PCR é positivo quando a quantidade de material genético produzido atinge o limiar de detecção do equipamento, logo quanto menor o número de ciclos necessários para se atingir esse limiar, mais RNA viral estava presente na amostra analisada. Notem que em vários dias o exame tem resultado negativo (toca a linha azul), e em muitos outros dias tem cargas virais bastante baixas. Podemos supor que cargas virais baixas potencialmente resultarão em falsos negativos quando amostras forem mal coletadas, incorretamente armazenadas e/ou processadas tardiamente ou com métodos/reagentes de menor qualidade.

Outro exemplo interessante é o dos primeiros 12 pacientes confirmados nos EUA. Novamente, temos que considerar que para terem sido diagnosticados eles precisaram ter resultados positivos, e não temos como saber quantos tiveram resultados negativos e foram erroneamente descartados. Notem a discordância frequente nos resultados de amostras coletadas no mesmo dia, porém de sítios diferentes.

Bolinha preta = teste positivo; bolinha branca = teste negativo, bolinha cinza = teste inconclusivo. NP = amostra de nasofaringe, OP = amostra de orofaringe, Sputum = amostra de escarro, Serum = amostra de sangue, Stool = amostra de fezes,. No eixo horizontal são dias desde o início dos sintomas. [https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.03.09.20032896v1]

Um estudo chinês cita (sem referências) que a taxa de positivação na primeira amostra é de 30-50%, mas que conseguiram atingir 78% ao fazer análise combinada de amostras de naso e orofaringe. Além disso, citam casos de pacientes que tiveram somente amostras de fezes positivas. Outra publicação chinesa com mais de 1000 pacientes mostra que o primeiro teste de RT-PCR foi negativo em ~40% casos.

Muito recentemente, um clinical trial brasileiro reportou que apenas ~50% dos pacientes recrutados foram confirmados por RT-PCR, mesmo utilizando o protocolo atualizado do CDC e coletando 2 amostras em dias diferentes de nasofaringe e orofaringe. Esses eram pacientes graves e clinicamente suspeitos a ponto de receberem tratamento com altas doses de cloroquina. Se em um contexto de um ensaio clínico importantíssimo, com equipes muito bem treinadas para coleta e processamento de repetidas amostras, apenas metade dos pacientes testou positivo, posso especular que a sensibilidade da RT-PCR seja ainda pior em condições normais.

Quais as explicações para esses exames negativos?

A primeira e mais simples explicação é que o SARS-CoV-2 possui um tempo de incubação, um ciclo de replicação em diferentes tecidos (vias aéreas superiores, vias aéreas inferiores, trato gastrointestinal) e uma curva de carga viral em cada tecido que é diferente conforme a progressão e gravidade da doença. Ainda estamos aprendendo sobre o vírus e sua fisiopatologia no organismo humano, e resultados publicados até o momento são frequentemente conflitantes. Mas é certo que amostras coletadas em um momento de baixa presença viral têm grandes chances de levar a resultados falsos negativos.

Outra razão é falha no processamento da amostra. Esse não é um exame em que uma gota de sangue ou uma amostra de urina é colocada em um equipamento que realiza uma análise automatizada e cospe um resultado. Técnicos com alto grau de treinamento precisam realizar vários passos de pipetagem e processamento para extração de RNA viral antes que o teste de RT-PCR possa finalmente ser realizado. E como vimos anteriormente, reagentes e protocolos diferentes podem levar a resultados diferentes. Erro humano é sempre possível, especialmente quando laboratórios estão trabalhando muito acima de sua capacidade.

Erros no transporte e armazenamento das amostras coletadas também são comuns. RNA degrada rapidamente em temperatura ambiente, e por isso as amostras devem ser imediatamente refrigeradas e analisadas o mais cedo possível. O guia de vigilância epidemiológica para COVID19 do MS diz “as amostras devem ser mantidas refrigeradas (4-8°C) e devem ser processadas dentro de 24 a 72 horas da coleta até chegar ao LACEN ou ao laboratório privado. Após esse período, recomenda-se congelar as amostras a -70°C até o envio ao laboratório, assegurando a manutenção da temperatura”. Isso contrasta com nossa realidade de laboratórios sobrecarregados, longas filas de exames e armazenamento incorreto de dezenas de milhares de amostras nos melhores laboratórios do país.

Potencialmente a principal causa de exames falsos negativos está relacionada a forma ou ao sítio de onde a amostra é coletada. Um swab de nasofaringe (vide figura abaixo) é um procedimento desconfortável (para dizer o mínimo) que precisa ser realizado por profissional treinado.

Com a progressão da pandemia e a necessidade de realizar centenas de milhares de testes, países mudaram suas regras para coleta de amostras para RT-PCR. Atualmente o Ministério da Saúde orienta coletar uma única amostra do swab combinado nasal/oral. Em comparação, para diagnóstico de Influenza, o próprio MS recomenda coletar 3 amostras (“2 de nasofaringe e 1 de orofaringe”). É possível que muitos locais estejam coletando amostras sem o treinamento adequado, realizando swab nasal anterior (fácil, rápido, indolor e incorreto) ao invés do mais complicado swab de nasofaringe. O próprio guia do MS é confuso em relação a isso (figura abaixo), já que parece ter sido copiado do guia de vigilância epidemiológica para Influenza. No entanto, para diagnóstico de influenza sabemos que a combinação de 2 amostras menos invasivas (nasal + oral) é equivalente em termos de sensibilidade a uma amostra de nasofaringe.

https://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/guia_laboratorial_influenza_vigilancia_influenza_brasil.pdf

Em pacientes graves, há indícios de que amostras de vias aéreas inferiores possuem maior sensibilidade quando comparadas a amostras de vias aéreas superiores para o mesmo paciente no mesmo dia. Esse estudo chinês mostrou 100% de amostras positivas (12/12) em lavado broncoalveolar em pacientes na segunda semana desde o início dos sintomas.

Já em casos leves, que não demandam hospitalização, os dados são mais confusos e extremamente influenciados pelo óbvio viés de seleção: somente casos que testaram positivo na primeira ou segunda amostra foram incluídos nos estudos, logo é esperado que qualquer estimativa de sensibilidade nesse grupo seja superestimada. Ao mesmo tempo, há evidências de replicação isolada do SARS-CoV-2 em vias aéreas superiores nos casos leves e de replicação em vias aéreas inferiores nos casos graves. Nos casos leves a carga viral parece ter seu pico no momento de aparecimento dos primeiros sintomas, ou logo nos primeiros dias após o início dos sintomas. Portanto quanto maior for a demora entre aparecimento dos sintomas e coleta do exame, maior a chance de um resultado falso negativo, como sugere esse estudo que modelou matematicamente a probabilidade de falsos-positivos conforme a data coletada. Mas como recomendação prática, durante a pandemia, todos com febre ou sintomas respiratórios devem se isolar por 14 dias independente do resultado de qualquer teste.

Probabilidade de um resultado positivo em teste de RT-PCR em pacientes sabidamente infectados conforme dia da coleta da amostra após início dos sintomas. Amostras de nasofaringe à esquerda e orofaringe à direita. [https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.05.20053355v1]

Em pacientes assintomáticos que são testados por serem contatos de outros pacientes confirmados, não temos nem idéia de qual seja a real sensibilidade do teste. Um teste positivo com certeza deve indicar isolamento imediato. Mas e no caso de resultado negativo? Minha interpretação é de que um (ou dois) testes negativos nessas condições não tem valor clínico algum, e a quarentena deve ser implementada independente do resultado para contatos próximos de pacientes confirmados. O que são contatos próximo com risco de transmissão? Pessoas que residem no mesmo domicílio (Odds Ratio 6.9), companheiros de viagem (Odds Ratio 7.1) e outros contatos descritos como “frequente” (Odds Ratio 8.8) (ref). Não faz sentido que testes negativos em pacientes assintomáticos sejam usados para determinar o retorno ao trabalho e “escapar” da quarentena. E o que acontece quando o paciente assintomático testa negativo dois dias seguidos, e no 4° dia acorda com dor de garganta? Ele solicitará um 3° teste ou terá falso senso de segurança que seus sintomas são decorrentes de um “resfriado comum”, tendo em vista que seus exames foram negativos?

Diagnóstico Clínico
Com a escassez mundial de equipamentos e reagentes e diante da projetada incapacidade do sistema brasileiro em realizar testes de RT-PCR em número suficiente para a população brasileira, devemos considerar a possibilidade de confirmação por diagnóstico clínico-radiológico, principalmente em pacientes que evoluam a óbito sem um diagnóstico laboratorial firmado. Este é um tema controverso, mas o gráfico abaixo mostra o impacto que a introdução do diagnóstico clínico teve no número total de casos COVID19 na China. Foi uma medida tomada enquanto o país ampliava sua capacidade de testes diagnósticos que ajudou no controle local da epidemia: casos confirmados mais rapidamente levaram a realização mais precoce do processo de busca ativa e isolamento de contatos.

Diagnóstico clínico-radiológico passou a ser permitido na China a partir do dia 12 de Fevereiro de 2020.

6 comentários em “O que significa um teste negativo para COVID19?

  1. Excelente Publicação. Deve chegar ao alcance de todos os profissionais que batalham no campo da pandemia COVID19. Em especial, a observação para a opção chinesa pelo Diagnóstico Clínico no desenrolar das pesquisas e das ações de saúde pública, é essencial nas decisões das autoridades brasileiras

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  2. Muito bom. Fico preocupado que agora vários municípios começam a implantar testes rápidos na população em geral (São José dos Pinhais no PR) ou a contabilizar casos de testes rápidos positivos de farmácia (Curitiba-PR).
    A pesquisa do Ibope realizada recentemente também tem seus resultados questionáveis, devido a provável baixa probabilidade pré-teste.
    Precisaríamos investir muito mais em educação dos médicos e demais profissionais de saúde, além da própria população. Algo que está longe de acontecer.

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  3. Excelente artigo. Refletir sobre a prática na coleta – com 3 swabs como até agora estava sendo feita e a nova proposta de apenas 2 swabs, em virtude de escassez de insumos, qual seria o impacto na eficácia do resultado.

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